Biotechnologia. Temat 3: Podstawowe techniki inżynierii genetycznej

Temat 3: Podstawowe techniki inżynierii genetycznej. 

Posty dotyczące tematu "Biotechnologia" przybierają formę opracowań i zawierają informacje pochodzące z podręcznika "Biologia na Czasie 1 - poziom podstawowy" dla szkół ponadgimnazjalnych wydawnictwa "Nowa Era"; Wikipedii; Wikibooks (podręcznik do nauki biologii dla liceum); podręczników do biologii wydawnictwa "Operon", podręcznika "Biologia" autorstwa Neil Campbell i Jane Reece. W postach tych starałem się zawrzeć istotę danych zagadnień, jednocześnie posługując się wieloma źródłami wiedzy. Poszczególne zagadnienia zostały wypunktowane w celu ułatwienia nauki. 

I. Enzymy stosowane w biotechnologii molekularnej:

W biotechnologii molekularnej komórki o określonych cechach uzyskuje się przez wprowadzenie zmian w ich DNA. Możliwe jest to dzięki wykorzystaniu enzymów - są to najczęściej Polimerazy DNA, enzymy restrykcyjne i ligazy. 

Polimerazy DNA - wykorzystywane są do powielania fragmentów DNA, np. wybranych genów. 

Wytwarzają nową nić DNA, komplementarną do matrycy, rozpoczynając od startera. Różnią się szybkością i dokładnością działania, a także zakresem temperatur, w których mogą być stosowane. Niektóre polimerazy DNA są stabilne w szerokim zakresie temperatur (termostabilne), dzięki czemu nie tracą aktywności nawet w wysokich temperaturach (ok. 95 stopni Celsjusza), np. Polimeraza Taq, którą izoluje się z bakterii Thermus aquaticus. 

Enzymy restrykcyjne (restryktazy) - służą do rozcinania DNA. Występują naturalnie w komórkach bakterii, gdzie służą do niszczenia kwasu nukleinowego wirusów podczas infekcji wirusowej. Każdy enzym restrykcyjny rozpoznaje i przecina określoną sekwencję DNA, składającą się zwykle z 4-8 par zasad. Są to zazwyczaj sekwencje palindromowe (identyczne, lecz odwrotne w stosunku do siebie)., np. 5'-GAATTC-3' i 3'-CTTAAG-5'. Odcinki DNA uzyskane w wyniku działania enzymów restrykcyjnych mogą być zakończone lepkimi końcami, lub dwuniciowymi - tępymi końcami. Do tej pory opisano kilkaset restryktaz, z któych każda rozpoznaje inną sekwencję DNA. 

Ligazy - enzymy, które łączą fragmenty DNA. Wytwarzają one wiązania fosfodiestrowe między nukleotydami należącymi do jednej nici cząsteczki DNA. Reakcja ligacji może zajść tylko wtedy, gdy końce, które mają zostać połączone, znajdą się wystarczająco blisko siebie. Najwydajniej przebiega zatem dla cząsteczek z komplementarnymi lepkimi końcami, które samoczynnie tworzą wiązania wodorowe. Jeżeli cząsteczki mają tępe końce, to ligacja jest mniej wydajna. 

II. CEL INŻYNIERII GENETYCZNEJ:

Celem biotechnologii molekularnej jest wytworzenie zrekombinowanego DNA - czyli DNA zawierającego fragmenty pochodzące od co najmniej dwóch różnych organizmów. 

III. BADANIE I IZOLOWANIE GENU:

Początkowym etapem tworzenia zrekombinowanego DNA jest odszukanie i wyizolowanie z genomu odpowiedniego genu. Jeżeli znamy sekwencję danego genu, możemy odszukać go za pomocą sondy molekularnej.

IV. HYBRYDYZACJA DNA Z UŻYCIEM SONDY MOLEKULARNEJ:

Sonda molekularna to krótki, sztucznie utworzony, jednoniciowy fragment kwasu nukleinowego, umożliwiający odszukanie określonego genu w materiale genetycznym. Łączy się on z nicią DNA o komplementarnej sekwencji nukleotydów. Dzięki temu, że jest oznakowany np. związkiem fluorescencyjnym wskazuje na położenie danej sekwencji. Takie połączenie się komplementarnych nici kwasów nukleinowych nazywamy hybrydyzacją DNA. 

Jeżeli nie wiadomo, jaką sekwencję ma poszukiwany gen, do jego wykrycia można użyć sondy zaprojektowanej do wyszukania genu o tej samej funkcji, pochodzącego z innego organizmu, ponieważ ma on często bardzo podobną sekwencję. W wypadku człowieka może to być np. sekwencja genu myszy. 

V. ANALIZA RESTRYKCYJNA I ELEKTROFOREZA DNA:

Jedną z metod przygotowania obcego genu jest wycięcie go z genomu za pomocą enzymów restrykcyjnych. By sprawdzić, czy proces przebiegł prawidłowo przeprowadzamy analizę restrykcyjną. 

Analiza restrykcyjna polega na rozcinaniu DNA wybranymi enzymami restrykcyjnymi, a następnie porównywaniu ilości i długości powstałych fragmentów DNA. Pozwala to na odróżnienie od siebie cząsteczek DNA. 

Fragmenty DNA o różnej długości można uwidocznić dzięki zastosowaniu elektoforezy DNA. Jest to technika rozdzielania DNA w specjalnym, porowatym żel pod wpływem działania pola elektrycznego. DNA przemieszcza się w żelu w kierunku elektrody dodatniej, ponieważ ma ładunek ujemny, nadany mu przez grupy fosforanowe. Cząsteczki DNA przemieszczają się tym szybciej, im są krótsze. 

VI. ŁAŃCUCHOWA REAKCJA POLIMERAZY:

Łańcuchowa reakcja polimerazy (Polymerase Chain Reaction - PCR) służy do powielania fragmentu DNA bez udziału komórek (w probówce), za pomocą polimerazy DNA - wykorzystujemy tu Polimerazę Taq.  Uzyskujemy w ten sposób miliony kopii wybranego odcinka DNA w czasie kilku godzin. Marycą może być wyizolowany z komórki odcinek DNA (wycięty enzymami restrykcyjnymi) lub cały DNA stanowiący genom. 

Do przeprowadzenia reakcji PCR nie trzeba znać sekwencji całęgo genu. Wystarczy znać sekwencję początkową i końcową, by zsyntezować startery. 

VII. SEKWENCJONOWANIE DNA:

Metoda Sangera, metoda dideoksy – jeden ze sposobów sekwencjonowania DNA, stanowiący (z różnymi modyfikacjami) podstawę odczytywania sekwencji DNA, polegający na kopiowaniu, katalizowanym przez polimerazę DNA, badanej cząsteczki DNA w warunkach in vitro. Autorem metody jest Frederick Sanger, który otrzymał za jej wynalezienie nagrodę Nobla w 1980 roku

Reakcja przeprowadzana jest w czterech wersjach (próbówkach), w każdej z nich przy wykorzystaniu próbki tego samego badanego DNA, ale różnych odczynników. W jednym z wariantów reakcja przeprowadzana jest tak, że wszystkie jej produkty zakończone są nukleotydem adeninowym. Powstają cząsteczki DNA, których sekwencja jest wprawdzie jeszcze nieznana, ale wiadomo, że są komplementarnymi kopiami pewnych fragmentów badanego DNA, a ich ostatnim nukleotydem jest nukleotyd adeninowy. Zgodnie z zasadą komplementarności adenina ma w matrycowym DNA swój odpowiednik w formie nukleotydu tyminowego. Ponieważ w naturalnych cząsteczkach DNA każdy z czterech rodzajów nukleotydów występuje wiele razy, to fragmenty zakończone jednego rodzaju nukleotydem mogą mieć bardzo różną długość. Wszystkie jednak fragmenty i to we wszystkich wariantach doświadczenia, zaczynają się takim samym odcinkiem - starterem – dodanym na początku reakcji wraz z pozostałymi substratami. Podobnie w pozostałych wariantach reakcji otrzymuje się produkty mające różną długość, lecz zawierające starter na jednym końcu (końcu 5'), a jednego rodzaju nukleotyd na drugim końcu (końcu 3'). Cztery możliwe warianty reakcji sekwencjonowania to wariant A - prowadzący do otrzymania różnej długości produktów zawsze zakończonych nukleotydem adeninowym, C - wszystkie produkty zakończone nukleotydem cytozynowym i analogicznie warianty dla T i G.

[starter]CTAPodczas kopiowania jednej cząsteczki DNA o tym, kiedy nastąpi przerwanie syntezy DNA, decyduje przypadek. Ponieważ każda z czterech próbówek zawiera miliony cząsteczek analizowanego DNA i każda z tych cząsteczek ulega kopiowaniu, to zgodnie z prawem wielkich liczb w próbówkach tych pojawiają się łańcuchy o wszelkich możliwych długościach (zależnych od sekwencji matrycy). Na przykład jeśli cząsteczka badanego DNA ma następującą postać: [odcinek komplementarny do startera]GATTCGA, to w reakcji typu A mogą powstać następujące trzy rodzaje produktów:

• [starter]CTAA
• [starter]CTAAGCT

DNA matrycowy (badany):

• [odcinek komplementarny do startera]GATTCGA.

Jak widać, od reguły, że w reakcji A wszystkie produkty zakończone są nukleotydem adeninowym może zdarzyć się wyjątek, ale dotyczy to tylko najdłuższych produktów, łatwych do rozpoznania (najdłuższe produkty pomija się w analizie). W próbówce wszystkie te cząsteczki są wymieszane, można je jednak uporządkować pod względem wielkości, poddając roztwory otrzymane po reakcji sekwencjonowania rozdziałowi elektroforetycznemu. Sanger zastosował do tego wysokorozdzielczą elektroforezę żelową, umożliwiającą rozróżnienie nawet łańcuchów DNA 

. 

ETAPY SEKWENCJONOWANIA DNA:

1. Polimeraza DNA syntezuje nową nić DNA, komplementarną do nici matrycowej, zaczynając od startera. Synteza nici DNA kończy się, gdy zostaje włączony oznakowany nukleotyd. 

2. Powstaje wiele cząsteczek jednoniciowego DNA o różnej długości, zakończonych oznakowanymi nukleotydami. 

3. Cząsteczki DNA są rozdzielane wg wielkości podczas elektroforezy. 

4. Cząsteczki DNA przesuwają się przed detektorem. Odczytuje on, który oznakowany nukleotyd znajduje się na końcu każdej z nich. Dane są przetwarzane na sekwencję badanego fragmentu DNA. 

VIII. WPROWADZENIE GENU DO GENOMU INNEGO ORGANIZMU:

Etap ten polega na wstawieniu wyizolowanego genu do genomu wybranego organizmu. W celu tym stosuje się zwykle klonowanie DNA i transformację genetyczną. 

IX. KLONOWANIE DNA:

Klonowaniem DNA nazywamy proces tworzenia kopii wybranego fragmentu DNA, np. genu, w komórkach (np. bakterii). Proces ten przebiega w dwóch etapach:

ETAP 1: Oddzielenie wybranego genu od reszty genomu i wstawienie go do przenośnika - wektora. 

ETAP 2: Wprowadzenie wektora ze wstawionym genem do wybranej komórki, w której jest on powielany podczas replikacji DNA.

X. WEKTORY

Wektor genetyczny to wykorzystywana w inżynierii genetycznej niewielka cząsteczka DNA (plazmid, DNA wirusa), służąca wprowadzeniu danej sekwencji DNA do komórki. Najpopularniejsze są wektory plazmidowe. Istnieją również wektory fagowe (wykorzystywanie bakteriofagów), sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC), sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC) i ludzkie (HAC). 

XI. BIBLIOTEKI GENOMOWE I cDNA:

W celu przechowywania całych genomów organizmów tworzy się biblioteki genomowe. Jedna biblioteka obejmuje zbiór komórek bakterii, które zawierają różne fragmenty genomu jednego organizmu. Wszystkie fragmenty zebrane razem składają się na kompletny genom. 

Do przechowywania samych sekwencji kodujących wybranego genomu stosuje się biblioteki cDNA. Przy ich tworzeniu wykorzystuje się fakt, że informacja genetyczna jest przepisywana na mRNA. Z komórek izoluje się mRNA i przeprowadza odwrotną transkrypcję. powstaje w ten sposób pula cząsteczek DNA niezawierających intronów, zwanych cząsteczkami cDNA. Łączy się je z cząsteczkami wektorów i wprowadza do bakterii.