Biotechnologia. Temat 6: Klonowanie.

Temat 6: Klonowanie. 
Posty dotyczące tematu "Biotechnologia" przybierają formę opracowań i zawierają informacje pochodzące z podręcznika "Biologia na Czasie 1 - poziom podstawowy" dla szkół ponadgimnazjalnych wydawnictwa "Nowa Era"; Wikipedii; Wikibooks (podręcznik do nauki biologii dla liceum); podręczników do biologii wydawnictwa "Operon", podręcznika "Biologia" autorstwa Neil Campbell i Jane Reece. W postach tych starałem się zawrzeć istotę danych zagadnień, jednocześnie posługując się wieloma źródłami wiedzy. Poszczególne zagadnienia zostały wypunktowane w celu ułatwienia nauki. 

PUNKTY:
1. Pojęcie klonowania i klonu.
2. Rozmnażanie bezpłciowe - przykład naturalnego klonowania.
3. Klonowanie DNA i klonowanie komórek.
4. Klonowanie roślin i zwierząt.
5. Klonowanie terapeutyczne i reprodukcyjne.

Powielanie nazywamy inaczej procesem amplifikacji. Oznacza on to samo, co klonowanie.

Mitoza jest przykładem klonowania naturalnego.

Cele klonowania: 
a) Komórek:
- pozyskiwanie różnych substancji,
- badanie toksyczności danej substancji

b) Organizmów wielokomórkowych:
- klonowanie ssaków z komórek ciała dorosłego osobnika; tworzenie hodowli ssaków transgenicznych - zwierzęta te stanowią często "żywe bioreaktory" - są w stanie produkować np. różnego rodzaju substancje lecznicze.

c) Genów: 
- badanie funkcji, struktury genów; badanie rozmaitych procesów przeprowadzania modyfikacji genetycznych; tworzenie bibliotek genomowych.

Mitospory - zarodniki roślin lub grzybów wytwarzane bezpłciowo w procesie mitozy. Są one przykładem klonowania zachodzącego w świecie przyrody.

Klonowanie roślin - stosuje się je w rolnictwie lub ogrodnictwie w celu uwypuklenia cech roślin macierzystych.

2) Pierwowzorem klonowania jest proces rozmnażania wegetatywnego, stanowiący jedną z form reprodukcji bezpłciowej. Potomstwo powstaje na drodze bezpośrednich mitotycznych podziałów komórkowych i uzyskuje zestaw genów identyczny z informacją zawartą w komórkach organizmu rodzicielskiego. Proces ten umożliwia szybkie zasiedlenie niszy ekologicznej, jednakże brak zmienności staje się przyczyną gorszego dostosowania do panujących warunków środowiskowych. Ten typ rozmnażania występuje u glonów, bakterii, pierwotniaków oraz roślin (kłącza, rozłogi, cebule, bulwy). Często wykorzystywany jest w ogrodnictwie do otrzymywania odmian o pożądanych cechach użytkowych.

Sposoby na naturalne klony:
a) Podział komórki (grzyby, protisty, bakterie),
b) Fragmentacja (rośliny),
c) Pączkowanie (Stułbia),
d) Partenogeneza (nicienie, skorupiaki, gekon),
e) Poliembronia - rozdzielenie się komórek zarodka we wczesnej fazie rozwoju (np. bliźnięta jednojajowe)

Klonowaniem nazywamy również dzieworództwo - partenogenezę. Podczas niej organizm kształtuje się z niezapłodnionej komórki jajowej. Brak udziału plemnika, umożliwia dokładne skopiowanie materiału genetycznego. Zjawisko to powszechnie występuje w świecie zwierząt, szczególnie wśród owadów. Nie występuje ono u ssaków. No chyba, że w serialach. Niemniej jednak teoretycznie partenogeneza również możliwa jest u ssaków, niektórzy nawet twierdzą, że u człowieka.

Poniżej filmik na temat partenogenezy człowieka i badań naukowych, które są prowadzone nad tym zjawiskiem u ssaków. Podany został np. myszy rozmnożonej tą metodą:

Klonami nazywamy również bliźnięta jednojajowe. Są to bowiem dwa płody, rozwijające się z jednej, zapłodnionej komórki jajowej. Normalnie węzeł zarodkowy zawiązuje się jako pojedyncza grupa komórek, ale w przypadku ciąży bliźniaczej tworzą się dwie takie grupy. Potomstwo rozwija się z jednej pary gamet i dlatego ma identyczny materiał genetyczny. 

Komórki zarodkowe do pewnego momentu mają maksymalną potencję, czyli zdolność do różnicowania się we wszystkie inne typy komórek. Nazywamy to totipotencją. Jest tak do czasu, aż powstanie blastocysta. Wtedy zarodek różnicuje się na dwie linie komórkowe: zarodkową (węzeł zarodkowy, embrioblast) i pozazarodkową (trofoblast, trofoektoderma). Z pierwszej powstanie właściwy zarodek, czyli nowy osobnik, z drugiej łożysko. Węzeł zarodkowy jest wciąż wysoce potentny. Może różnicować się we wszystkie typy komórek, poza łożyskowymi. Nazywamy to pluripotencją. Zarówno jedne, jak i drugie są komórkami macierzystymi.

Jeżeli rozdzielimy totipotentne komórki wczesnego zarodka, otrzymamy dwa zarodki. W taki mniej więcej sposób powstają bliźniaki jednojajowe. 

 Zarodki mogą się również czasem absorbować. Jeżeli mamy dwa całkowicie odrębne embriony, powstałe w wyniku połączenia się dwóch różnych oocytów z dwoma różnymi plemnikami, to mają one inne od siebie DNA. Są zatem bliźniakami dwujajowymi. Jeżeli jednak na odpowiednio wczesnym etapie jeden z nich pochłonie drugiego, to z dwóch embrionów powstanie jeden, o mieszanym stosunku genomów. Część jego ciała będzie miała jego własne DNA, a część jego brata/siostry bliźniaka. Osoby takie to chimery lub mozaiki. Jeśli dana osoba ma oczy w różnych kolorach, to możliwe, że jest chimerą. Zwłaszcza, jeśli to mężczyzna (bo kobiety zawsze są trochę chimerami, niezależnie od zjadania rodzeństwa – jeden ich chromosom X jest w części komórek wyłączony i w niektórych miejscach ekspresji genetycznej ulega u kobiety X od matki, a w innych – od ojca).  

Męskie DNA promuje rozwój łożyska, a żeńskie – węzła zarodkowego. Jeżeli zapłodnimy pusty oocyt męskim DNA, to rozwija się patologiczne łożysko, a jeżeli mamy niezapłodnione oocyty, z materiałem genetycznym żeńskim, to po ich aktywacji np. impulsem elektrycznym, rozwijają się partenogenetyczne zarodki (klony), które i tak przez niedorozwój trofoblastu obumierają. 

Jak mogą być położone bliźnięta w macicy matki przed porodem? Poniższy film to wyjaśnia:

3) Klonowanie DNA i klonowanie komórek. 

Klonowanie DNA bazuje na replikacji DNA, gdzie namnożona zostaje pożądana sekwencja dzięki podziałom mitotycznym komórek gospodarza lub bezpośredniemu kopiowaniu zawierającego ją wektora. Metoda ta pozwala na izolację oraz powielenie konkretnych genów w celu poddawania ich dalszym analizom. Określenie roli kodowanych białek lub fragmentów DNA umożliwia identyfikacje funkcji klonowanych sekwencji i ewentualne wykrycie ich ewentualnych mutacji. 

Aby przeprowadzić klonowanie molekularne potrzebny jest odpowiedni fragment DNA - sekwencja, którą zamierzamy powielić. Jest ona najczęściej wyizolowywana z komórek dawcy lub chemicznie syntezowana z wykorzystaniem reakcji PCR. DNA może pochodzić od dowolnego organizmu; musi jednak zostać połączone z odpowiednim nośnikiem zdolnym do autonomicznej replikacji w komórkach biorcy. Tzw. wektor klonujący to jeden z typów wektora genetycznego - sztucznie skonstruowanej cząsteczki DNA. Wykorzystujemy w klonowaniu głównie wektory plazmidowe i wirusowe, które zapewniają powielenie się danego DNA w organizmie gospodarza.

Dobry wektor powinien być przekazywany jedynie z komórek macierzystych do komórek potomnych. W jego strukturę wprowadza się również silny promotor, warunkujący wysoką ekspresję i syntetyczny nukleotyd rozpoznawany przez różne enzymy restrykcyjne - inaczej - polilinker. Umożliwa on wbudowanie w strukturę nośnika fragmentu przeznaczonego do klonowania - insertu, lub inaczej - wstawki. Powinien zawierać również geny markerowe, np. kodujące powstawanie danego barwnika lub geny oporności na antybiotyki. 

KLONOWANIE DNA MA 4 ETAPY:

1. FRAGMENTACJA: odcinek DNA przeznaczony do klonowania musi zostać pocięty za pomocą odpowiednich restryktaz. 

2. LIGACJA: pocięcie wektora restryktazami, by uzyskać na nim końce komplementarne do klonowanej sekwencji. Następnie połączenie sekwencji ligazą. 

3. TRANSFEKCJA: wprowadzenie wbudowanych w wektor cząsteczek DNA do komórek biorcy, np. przez wymieszanie z bakteriami o wzbudzonej kompetencji, np. przez potraktowanie ich chlorkiem wapnia.

4. SELEKCJA: Dzięki genom oporności na antybiotyki, bakterie, które pochłonęły plazmid, mogą rosnąć na odpowiednich pożywkach. Bakterie tworzą na owych pożywkach kolonie, gdzie każda bakteria zawiera ten sam plazmid, a zatem to samo DNA (fragment) w sobie. 

KLONOWANIE KOMÓREK I MIKROORGANIZMÓW: 

Celami klonowania komórek jest otrzymywanie określonej substancji, np. leku produkowanego przez dane mikroorganizmy, a także testowanie toksyczności substancji, np. hodowle klonów, fibroblastów - komórek tkanki łącznej. 

Uzyskiwanie klonów komórek i mikroorganizmów jest proste. Wystarczy je przenieść na odpowiednie podłoże, umożliwiając im wzrost i rozmnażanie, a następnie rozdzielić je za pomocą posiewu (rozprowadzenia niewielkiej ilości komórek na stałym podłożu, np. agarowym, by pojedyncze komórki były od siebie oddzielone). Każda kropka stanowić będzie zbiór klonów bakterii.

4) Klonowanie roślin i zwierząt: 

I. Klonowanie roślin:

a) wegetatywne (w sadownictwie, rolnictwie, ogrodnictwie),

b) mikrorozmnażanie 

Mikrorozmnażanie polega na otrzymywaniu wielu identycznych roślin potomnych z fragmentów rośliny macierzystej. Pobieranym materiałem mogą być zawiązki pędów lub skrawki liścia, czy łodygi. Fragmenty rośliny umieszcza się w pożywce, gdzie komórki tkanek stałych odzyskują zdolność do podziału. W wyniku podziałów powstaje tkanka kalusowa. W trakcie dalszej hodowli komórek - dzielą się one w sposób uporządkowany, dzięki czemu powstaje nowa roślina. 

Etapy: 

1. Założenie hodowli.

2. Rozmnażanie roślin.

3. Adaptacja do warunków naturalnych.

Poniżej prezentuję Wam moje znalezisko - bardzo ciekawy kanał na YT poświęcony uprawie roślin w kulturach in vitro i wszelkim konstrukcjom z tym związanym. Prowadzący ma nietypowe hobby, ciekawie o nim opowiada, dobrze przekazuje swoją praktyczną wiedzę - jego porady są bardzo cenne, bo możecie nauczyć się w sposób prawidłowy rozmnażać rośliny samodzielnie :)

II. Klonowanie zwierząt:

Zwierzęta powielane są po to, by powielić osobniki mające cechy cenne pod względem hodowlanym. Są to np. zwierzęta GMO stosowane w rolnictwie i farmacji. Klonuje się je po to, by mieć pewność, że dana cecha wystąpi u wszystkich osobników potomnych. Ponadto klony wykorzystywane mogą być w medycynie do testowania leków. Przewiduje się również zastosowanie klonowania w ochronie przyrody, do zwiększania liczebności gatunków, które są zagrożone wyginięciem. 

Uzyskiwanie klonów zwierząt jest trudne. ZRÓŻNICOWANE KOMÓRKI ZWIERZĘCE, W ODRÓŻNIENIU OD KOMÓREK ROŚLINNYCH, NIE DZIELĄ SIĘ W HODOWLI, A TAKŻE SŁABO ROZWIJAJĄ SIĘ W TKANKI NOWEGO ORGANIZMU. 

Początkowo próby klonowania zwierząt opierały się na uzyskiwaniu klonów przez rozdzielenie komórek zarodka we wczesnych etapach jego rozwoju. Następnie naukowcy próbowali przenosić jądro komórki zróżnicowanej do cytoplazmy komórki zarodkowej. 

METODY KLONOWANIA ZWIERZĄT:

1. TRANSPLANTACJA JĄDER KOMÓRKOWYCH 

2. ROZDZIELENIE KOMÓREK ZARODKA

Komórki budujące zarodek na wczesnym etapie rozwoju rozdziela się, a następnie hoduje w odpowiednich warunkach laboratoryjnych do stadium moruli lub blastocysty. 

Wydajność procesu klonowania zwierząt jest niska (~10%). Przykładowe problemy to:

a) Zaburzenia funkcji łożyska,

b) Nieudane zapłodnienia, 

c) Zagnieżdżenia zarodka

d) Zaburzenia przebiegu ciąży

e) Wady płodów

Wiele osobników rodzi się ponadto nie w pełni zdrowych. 

5) Klonowanie terapeutyczne i reprodukcyjne.

Klonowanie terapeutyczne polega na klonowaniu niezróżnicowanych komórek zarodka (zarodkowych komórek macierzystych) w celach leczniczych. Przeszczepia się je w miejsce uszkodzonych tkanek lub wytwarza z nich tkanki i narządy wykorzystywane w leczeniu niektórych chorób. 

Klonowanie reprodukcyjne polega na powielenie komórek zarodka w celu uzyskania kilku zarodków, z których rozwinie się dorosły organizm (z każdego zarodka). Nie przeprowadza się go ze względów etycznych. 

Klonujemy zwierzęta inne niż ludzie i pytanie się pojawia: a dlaczego nie moglibyśmy tak zrobić sobie kopii człowieka, czyli przeprowadzić klonowanie reprodukcyjne. Granice stawia bioetyka, a także prawo - konkretnie prawna ochrona ludzkich embrionów. W poniższym filmie wiele wątpliwości dotyczących klonowania reprodukcyjnego człowieka rozwiewa prof. S Cebrat - genetyk z Uniwersytetu Wrocławskiego:

Polecam również zapoznać się z wykładem prof. Piotra Stępnia poświęconemu zagadnieniu klonowania człowieka:

EKSPERYMENT JOHNA GURDONA:

Źródło: Journal of Cell Biology (JCB) -
artykuł pt. "John Gurdon: Godfather of
cloning" - kliknij i przeczytaj.

John Gurdon prowadził  doświadczenia na płazie bezogoniastym Xenopus laevis. Okazało się, że przeszczepienie jądra komórkowego pochodzącego nawet z bardzo wyspecjalizowanych komórek, np. naskórka, limfocytu, erytrocytu, itd. do oocytu płaza, który wcześniej został pozbawiony własnego materiału genetycznego, doprowadzić może do zakończonego sukcesem rozwoju zarodkowego. Wykazano zatem, że komórki dorosłego organizmu zachowują całą informację umożliwiającą przeprowadzenie rozwoju zarodkowego.

Różnicowanie komórek ssaków też jest "odwracalne":

Wczesne próby powtórzenia u ssaków opisanych doświadczeń prowadzonych na płazach przyniosły rozczarowanie. Podejrzewano, że "odwracalność" procesu różnicowania mogła dotyczyć wyłącznie niższych kręgowców, a nie ssaków. Takie wnioski wyciągnęli - za pomocą obserwacji rozwoju mysich zarodków - naukowcy McGrath i Solter. Mysie zarodki uzyskiwane były metodą transplantacji jąder komórkowycb blastomerów, do zygot pozbawionych własnego materiału genetycznego. Uzyskali oni pełen rozwój zarodkowy wyłącznie wtedy, gdy do doświadczeń użyli jąder komórkowych pochodzących z blastomerów zarodków dwukomórkowych.

Dopiero kolejne próby klonowanie, w których do oocytów przeszczepiano jądra komórek somatycznych izolowanych z zarodków owiec dały pozytywne wyniki. Następnie powtórzono te doświadczenia na komórkach krowy. Przełomowymi okazały się doświadczenia Iana Wilmuta, Keitha Campbella i współpracowników. Udało im się bowiem sklonować owcę Dolly. Doświadczenie ich polegało na przeniesieniu jądra zróżnicowanej komórki nabłonkowej gruczołu mlekowego dorosłej owcy do oocytu pozbawionego własnego jądra. 

Zarodkowe komórki macierzyste:

Równocześnie z pracami Kinga, Briggsa i Gurdona prowadzono badania nad komórki pluripotencjalnymi - takimi, które mogą się różnicować we wszystkie tkanki budujące organizm. Zwrócono najpierw uwagę na tzw. potworniaki - już w 1941 roku stwierdzono, że mogą zawierać one komórki zdolne do różnicowania się we wszystkie tkanki budujące organizm. Kolejne analizy potwierdziły te przypuszczenia i tak oto udało się naukowcom uzyskać pierwszą linię komórek pluripotencjalnych, a były to komórki raka zarodkowego. Wyniki doświadczeń, w których badano zdolność do różnicowania się komórek uzyskanych z potworniaków i stwierdzenie, iż potworniaki powstają z komórek rozrodczych zainicjowały prace, które doprowadziły z kolei do uzyskania pierwszych linii mysich zarodkowych komórek macierzystych. 

Źródło: Wikipedia. Potworniak.

Komórki macierzyste cechują różne zdolności różnicowania. Możemy je zatem podzielić wg tego kryterium. 

Podsumowując: zakończone sukcesem badania Gurdona, Wilmuta i wielu innych badaczy udowodniły, że możliwe jest klonowanie zwierząt. Stanowi ono reprogramowanie jądra komórek somatycznych przez cytoplazmę oocytu. Do dziś nie wiadomo w jaki dokładnie sposób cytoplazma oocytu do którego wprowadzono jądro zróżnicowanej komórki powoduje jego reprogramowanie. Związane jest to z ekspresją genów. 

Źródła: From Gurdon to Yamanaka - a brief history of cell reprogramming - Jacek Z. Kubiak, Maria Anna Ciemierych; Wikipedia + podręcznik dla szkół ponadgimnazjalnych do Biologii dostępny online na Wikibooks.