Mikroskop wykorzystano także do obserwacji podziału chromosomów w jądrze komórkowym. W roku 1910 Thomas Hunt Morgan udowodnił, że chromosomy są nośnikami genów dając jednocześnie początek genetyce. W technologii materiałowej mikroskopy wykorzystywano do obserwacji struktur metali lub innych materiałów. Możliwe dzięki temu stało się opracowywanie doskonalszych stopów metali wykorzystywanych w przemyśle.
Kolejnym przełomem stało się wykorzystanie w mikroskopie elektronów. W roku 1931 pierwszy mikroskop elektronowy skonstruowali Ernst Ruska i Maksem Knollem w Berlinie. Możliwa stała się wówczas obserwacja najmniejszych struktur organelli komórkowych. W technologii wykorzystanie mikroskopów elektronowych stało się podstawą tzw. rewolucji krzemowej. Bez technik sprawdzania jakości wykonywanych w półprzewodnikach struktur nie udałoby się dokonać tak ogromnego postępu w tej dziedzinie.
W roku 1982 mikroskopia uczyniła z kolei pierwszy krok w kierunku świata atomów. Pracujący w Zurychu naukowcy Gerd Binnig oraz Heinrich Rohrer skonstruowali mikroskop STM (Skaningowy mikroskop tunelowy). Pozwolił on na obserwację struktur złożonych z pojedynczych atomów. Późniejsze prace doprowadziły do budowy szeregu odmian tego mikroskopu pozwalających na badanie różnych właściwości materii w skali nanometra. Niezwykłą cechą mikroskopu STM była jego zdolność nie tylko do obserwacji atomów, ale również manipulacji nimi - przekładania ich z miejsce na miejsce po jednym. Obecnie badacze przewidują, że postęp w mikroskopii pozwoli na zapoczątkowanie rozwoju nanotechnologii, która może znaleźć zastosowanie w prawie każdej dziedzinie życia.
ZDOLNOŚĆ ROZDZIELCZA:
ROLA POSZCZEGÓLNYCH ELEMENTÓW MIKROSKOPU:
POPRAWKA -> Powinno być napisane: "Zdolność rozdzielczą obiektywu można POMNIEJSZYĆ, itd. (bez zmian)...". (patrz: to wynika ze wzoru d=lambda/2*A
ROLA POSZCZEGÓLNYCH ELEMENTÓW MIKROSKOPU:
PORÓWNANIE MIKROSKOPU ELEKTRONOWEGO I OPTYCZNEGO:
Mikroskop elektronowy to mikroskop wykorzystujący do obrazowania wiązkę elektronów. Mikroskop elektronowy pozwala badać strukturę materii na poziomie atomowym. Im większa jest energia elektronów tym krótsza ich fala i większa rozdzielczość mikroskopu. Próbka znajduje się w próżni i najczęściej jest pokrywana warstewką metalu. Wiązka elektronów przemiata badany obiekt i trafia do detektorów. Urządzenia elektroniczne odtwarzają na podstawie zmierzonych sygnałów obrazu badanej próbki. Pierwszy mikroskop elektronowy skonstruował w 1931 r. Ernst Ruska razem z Maksem Knollem w Berlinie.
Podstawowym parametrem mikroskopy jest zdolność rozdzielcza, która określa rozmiary najmniejszych szczegółów jakie da się dostrzec w badanej próbce. Zdolność rozdzeilczą mikroskopu optycznego ogranicza dyfrakcja (zjawisko fizyczne zmiany kierunku rozchodzenia się fali) promieni tworzących obraz. Im mniejsza jest długość fali, tym mniejszy obiekt można obserwować. Granica rozdzielczości mikroskopu optycznego wynosi około 200 nm (z wyjątkiem SNOM - Skaningowego mikroskopu pola bliskiego - mikroskopu w którym sondą skanującą jest stożek świetlny. Wiązka światła widzialnego padająca na próbkę odbija się wówczas od powierzchni lub przechodzi trafiając do detektora; jej intensywność bada się we wszystkich możliwych punktach, co daje obraz obiektu).
W roku 1905 Albert Einstein wyjaśnił zjawiska związane z efektem fotoelektrycznym, proponując istnienie hipotetycznych cząstek światła nazwanych później fotonami. Światło ponadto ujawniło swą dwoistą naturę. W pewnych sytuacjach bowiem zachowuje się ono jak fala, zaś w innych jak strumień cząstek. W roku 1924 Louis de Broglie zaproponował hipotezę, wg której cząstki elementarne miały podobną dwoistą naturę. Każda z nich jest zarówno cząstką jak i falą, której długość zależy od pędu cząstki. Pęd fotonów jest niewielki i dlatego długość fali świetlnej jest relatywnie duża w skali mikroświata. Nawet najlżejsze cząstki elementarne mają pęd znacznie większy od fotonów. W ten sposób narodził się pomysł wykorzystania elektronów w mikroskopii. Pierwszy mikroskop elektronowy skonstruował w 1931 roku Ernst Ruska razem z Mkasem Knollem w Berlinie. Na Uniwersytecie w Aberdeen George Paget Thomson przepuścił wiązkę elektronów przez cienką folię metalową i zaobserwował obrazy dyfrakcyjne fal materii. W Laboratoriach firmy bell Clinton Joseph Davisson i Lester Halbert Germer prześwietlili wiązką elektronów próbkę kryształu uzyskując obrazy dyfrakcyjne. W roku 1937 Thomson i Davisson wspólnie otrzymali za swoje prace Nagrodę Nobla z fizyki.
TYPY MIKROSKOPÓW ELEKTRONOWYCH: Ogólnie mikroskopy elektronowe można podzielić na zwykłe i skaningowe. W mikroskopach zwykłych jednocześnie jest analizowany duży obszar powierzchni preparatu i tworzony jest jego obraz. W mikroskopach skaningowych w danym momencie analizowany jest niewielki obszar, który jest traktowany jako punkt. Tworzenie obrazu następuje poprzez zebranie informacji z kolejno analizowanych punktów.
Pierwowzorem, a jednocześnie najprostszym mikroskopem elektronowym jest projektor elektronowy, zwany mikroskopem polowym. W mikroskopie polowym silne pole elektryczne jest wykorzystywane do emisji polowej i uzyskania obrazu. Pierwszy projektor zbudował w 1936 roku fizyk niemiecki Erwin Müller. Umieszczona w próżni katoda w postaci ostrza o bardzo małym promieniu krzywizny lub kryształu umieszczonego narożnikiem umieszczona jest w szklanej kolbie stożkowej, której dno jest pokryte luminoforem. Anodę stanowi pokryta materiałem przewodzącym powierzchnia boczna kolby lub pierścień z metalu umieszczony na drodze katoda - ekran. Przyłożenie napięcia rzędu kilkudziesięciu tysięcy woltów między katodę a anodę wywołuje natężenie pola w pobliżu ostrza rzędu milionów woltów na metr co wywołuje emisję polową z katody. Emitowane elektrony przyspieszane przyłożonym polem rozbiegają się promieniście tworząc obraz ostrza katody. Mikroskop stosuje się do badania emisji polowej, obserwacji kryształów, ich wad, adsorpcji i ruchu adsorbowanych atomów na ostrzach. Mikroskopy te zapoczątkowały konstrukcje innych mikroskopów elektronowych.
ELEKTRONOWY MIKROSKOP TRANSMISYJNY - Elektronowy Mikroskop Transmisyjny to mikroskop w którym rejestrowane są elektrony przechodzące przez próbkę. Próbka w takim mikroskopie musi być cienką płytką o grubości mniejszej od 0,1 mikrometra. Przygotowanie takiej próbki jest trudne i znacznie ogranicza zastosowania mikroskopu.
Najważniejszy element mikroskopu elektronowego to kolumna mikroskopu.
Kolumna mikroskopu zawiera działo elektronowe - element urządzeń wytwarzający odpowiednio skierowany strumień elektronów o odpowiedniej energii. Działo elektronowe jest elementem kineskopów, mikroskopów elektronowych, źródłem elektronów w akceleratorach cząstek. Składa się ona z katody - elektrody emitującej elektrony; elektrody ogniskującej, która umożliwia uzyskanie na ekranie plamki o bardzo małej powierzchni (zwykle jest to cylinder Wehnelta, czyli niewielki cylinder z otworkiem, otaczający katodę). Cylinder ma potencjał ujemny względem katody, zmiana potencjału zmienia natężenie wiązki elektronów, a przez to jasność świecącej plamki w kineskopie. Anoda, składająca się z jednej lub kilku cylindrycznych elektrod o różnych średnicach, stanowią układ przyspieszający i ogniskujący. Istnieją dwa główne typy dział elektronowych wykorzystujących zjawisko termoemisji lub emisję polową. Najprostsze działo elektronowe to wolframowe włókno (katoda). Jest ono nagrzewane w próżni do temperatury około 2800K. Elektrony uzyskują energię, która pozwala, aby opuściły katodę. Emitowane elektrony są kolimowane i ogniskowane przy pomocy cylindra Wehnelta (pole elektrostatyczne). Wiązka pierwotna ma wtedy średnicę około 50μm. Potencjał przyłożony do anody wynosi od 1 do 20KV. Przyspieszenie elektronów następuje w wyniku dużej różnicy potencjałów pomiędzy katodą a anodą.
SKANINGOWY MIKROSKOP ELEKTRONOWY: Długość fali przyspieszanych elektronów jest w przypadku SEM dużo mniejsza niż długość fali światła widzialnego, co zapewnia dużo lepszą rozdzielczość aniżeli w mikroskopii świetlnej. Dla światła długość fali wynosi 350-750 nm, natomiast długość fali wiązki elektronów dochodzi do 0,05 nm. W przypadku mikroskopu świetlnego można uzyskać maksymalne powiększenie rzędu 2000x, w przypadku SEM może ono wynieść nawet 3 000 000x. Wymogiem każdej techniki mikroskopii elektronowej ejst próżnia wynosząca co najmniej 10−4 Pa.
 |
| Źródło: http://sygryda.freehost.pl |
ZASADY MIKROSKOPOWANIA:
Biologiczny preparat mikroskopowy to część tkanki organicznej przygotowana do obserwacji mikroskopowej. Sposób preparowania próbki zależy od rodzaju mikroskopu i celu badań.
Preparat przeznaczony do badania mikroskopem optycznym powinien spełniać następujące warunki:
1. Powinien być bardzo cienki z powodu przezroczystości dla światła i nienakładania się struktur z różnych warstw preparatu.
2. Powinien być trwały mechanicznie, czyli nie wysychać, nie kurczyć się, nie pękać.
3. Powinien być trwały biologicznie - nie ulegać biodegradacji, np. z powodu grzybów lub bakterii.
ETAPY OBRÓBKI:
By spełnione zostały wymagania przedstawione powyżej, badany obiekt musi zostać:
1) Pocięty na cienkie plastry (ręcznie lub za pomocą mikrotomu). Jedynie drobne obiekty biologiczne, np. mikroorganizmy, niewielkie bezkręgowce, pyłek roślin i zarodniki są badane w całości.
2) Wysuszony lub woda powinna być zastąpiona substancją neutralną biologicznie, bądź substancją o właściwościach bakterio- i grzybobójczych.
3) W razie konieczności wybarwiony, w celu uwidocznienia naturalnie przejrzystych struktur biologicznych lub dla poprawienia kontrastu.
4) Umieszczony na szkiełku podstawowym i nakryty szkiełkiem nakrywkowym. Szkiełko nakrywkowe jest hermetycznie przyklejone do podstawowego, by odizolować preparat od wpływu otoczenia. Zamiast stosowania dwóch oddzielnych szkiełek, używa się również slajdów, czyli szkiełek sklejonych fabrycznie. Slajdy mogą być napełniane płynnym preparatem, po czym uszczelniane.
Proste preparaty, które przeznaczone są do niezbyt dużych powiększeń, mogą być przygotowywane ręcznie przy pomocy skalpela i typowych odczynników chemicznych takich jak parafina, wosk i barwniki. Przy bardzo małych powiększeniach można nawet zrezygnować z całego procesu preparacji i umieścić próbkę na szalce Petriego. W przypadku bardziej zaawansowanych obserwacji mikroskopowych, do przygotowania preparatów mikroskopowych służy też specjalny przyrząd - mikrotom.
Jak wykonać preparat wodny? (przykład preparatu nietrwałego)
Jak wykonać preparat wodny? (przykład preparatu nietrwałego)
 |
| Źródło: perucsd.org |
SZKIEŁKO PODSTAWOWE: Szkiełko podstawowe zwane także przedmiotowym to prostokątna płytka szklana, która służy do umieszczenia na niej materiału obserwowanego za pomocą mikroskopu. Szkiełko podstawowe umieszczane jest na stoliku przedmiotowym mikroskopu.
Może to być zwykły fragment szkła lub specjalnie przygotowany szkła lub też specjalnie przygotowany do określonych celów, jak np. hemocytometr służący do liczenia komórek. Powierzchnia może być cała gładka lub posiadać matowe pole, które umożliwia podpisanie preparatu. Brzegi mogą być cięte lub szlifowane. Szkiełka podstawowe mają zwykle wymiary 76 x 26 x 1mm lub zbliżone, np.: 25,4 x 76,2 x 1,2 mm.
Stolik przedmiotowy - jest to element mikroskopu - stolik służący do położenia na nim szkiełka podstawowego wraz z obiektem przeznaczonym do obserwacji. Posiada on zwykle dwa sprężynujące "zaczepy", które uniemożliwiają przypadkowe przemieszczanie się na nim szkiełka podstawowego. Jest czworoboczny lub okrągły z otworem w środku (na światło), nieruchomy lub przesuwany za pomocą dwóch śrub osadzonych poziomo. Istnieją także stoliki grzejne, które umożliwiają kontrolowanie temperatury analizowanego obiektu, dzięki czemu można zaobserwować wpływ zmian temperatury na dany organizm.
Hemocytometr - jest to przyrząd służący do liczenia małych elementów w preparacie mikroskopowym. Pierwotnie służył on do liczenia komórek krwi, stąd też jego nazwa (hemo - krew, cyto - komórka, -metr - przyrząd do mierzenia). Ma on postać szklanej płytki (szkiełko podstawowe), na której znajduje się prostokątny obszar pomiarowy otoczony wyżłobieniem. W obszarze pomiarowym metodą laserowego rytowania, naniesiona jest siatka prostopadłych linii która dzieli ten obszar na podobszary (komórki pomiarowe). Rozmiary tych komórek są ściśle określone i podane na płytce, np. 0,20x0,20mm. Ponieważ znana jest również wysokość, czyli odległość do szkiełka nakrywkowego (zwykle 0,2 mm), łatwo można obliczyć objętość pojedynczej komórki pomiarowej. Mała odległość pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym a podstawowym powoduje, że płynny preparat wypełnia przestrzeń komórki, a jego nadmiar spływa do wyżłobienia. Wyznaczając podczas obserwacji mikroskopowej liczbę badanych obiektów (np. białych krwinek), można obliczyćich koncentrację, czyli ich liczbę na jednostkę objętości.
SPOSÓB UŻYCIA:
1. Rozcieńczenie preparatu, konieczne, gdy preparat jest zbyt gęsty lub ilość badanych obiektów jest bardzo duża i są one bardzo małe. Bez rozcieńczenia, byłoby ich zbyt dużo w jednej komórce pomiarowej i mogłyby się wzajemnie przesłaniać. Proporcje rozcieńczania powinny być precyzyjnie ustalone, by można było obliczyć koncentrację w preparacie oryginalnym.
2. Dokładne wymieszanie z rozcieńczalnikiem w celu uzyskania jednorodnego rozkładu badanych obiektów.
3. Kilkakrotne powtórzenie pomiarów dla różnych komórek pomiarowych i obliczenie średniej. Jeżeli poszczególne pomiary różnią się bardzo od siebie, należy zwiększyć ich ilość w celu uzyskania lepszej statystyki i zredukowania błędu.
MIKROTOM - jest to przyrząd służący do cięcia preparatów biologicznych na bardzo cienkie skrawki do obserwacji mikroskopowej. Mikrotomy mogą być całkowicie mechaniczne, lub półautomatyczne, gdzie wszelkie ustawienia i ruch ostrza są kierowane przez operatora, lub też bardzo zaawansowane, sterowane komputerowo, gdzie wszystkim zawiadują podzespoły elektroniczne. Większość mikrotomów ma stalowe ostrza, ale są także mikrotomy z ostrzem szklanym, powstałym z przełamania bloczku szklanego czy też z ostrzem diamentowym. W mikrotomach stosuje się również cięcie laserem. Najpopularniejszymi typami i zastosowaniami mikrotomów są:
a) Techniki histologiczne - tkanka jest tu poddawana cięciu i utwardzana poprzez wymianę w niej wody na parafinę. Następnie jest ona cięta na skrawki o grubości od 2 do 25 mikrometrów. Taki skrawek może być obserwowany bezpośrednio pod mikroskopem lub odpowiednio barwiony, zależnie od przeznaczenia.
b) Kriosekcja - bogate w wodę próbki zamraża się (często w obecności krioprotektantów (substancji lub mieszanin substancji chroniących zamrażany obiekt) lub po zamianie w nich wody na podobne związki, w celu uniknięcia zniszczenia tkanki przez kryształy lodu), a następnie tnie na skrawki. Technika ta jest szybsza aniżeli opisana histologiczna i często używa się jej jako szybkiej metody przygotowania próbki do natychmiastowej diagnozy. Kriosekcja może także być używana w immunohistochemii, jako że tak spreparowane próbki zachowują swoje właściwości biologiczno-chemiczne i mogą na przykład dawać reakcję z przeciwciałami.
c) Mikroskopia elektronowa - próbki utrwala się tu w żywicy epoksydowej (rodzaju jedno- lub dwuskładnikowych żywic syntetycznych, które są zdolne do tworzenia nietopliwych i nierozpuszczalnych tworzyw sztucznych na skutek reakcji sieciowania z udziałem ugrupowań epoksydowych; składnikami żywic epoksydowych są zwykle polifenole, rzadziej poliglikole, oraz epichlorohydryna lub oligomery posiadające na końcach ugrupowania epoksydowe) i później tnie na mikrotomie wyposażonym w szklane lub diamentowe ostrze na niezwykle cienkie skrawki (grubość od 60 do 100 nanometrów). Skrawki są zwykle barwione i badane w transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Mikrotom do takich zastosowań nazywa się często ultramikrotomem.
d) Mikrotom botaniczny - używa się go dla twardych materiałów jak drewno, ale również kość czy skóra. Ostrza tutaj są bardziej masywne i nie uzyskuje się tak cienkich skrawków.
e) Mikrotom laserowy - jest to przyrząd służący do bezdotykowego cięcia preparatów biologicznych na bardzo cienkie skrawki do obserwacji mikroskopowej. W przeciwieństwie do zwykłego mikrotomu, do cięcia próbki używany jest laser, a sama próbki nie wymaga żadnego dodatkowego przygotowania, jak zamrażanie, odwadnianie czy utrwalanie w żywicy. Mikrotomem laserowym można ciąć preparat na skrawki o grubości zwykle od 10 do 100 µm.
PLAYLISTA: KLIK!
Brak komentarzy:
Prześlij komentarz